Cell | 新的RNA递送体系促进肿瘤免疫治疗

原创存中一贯 BioArt

撰文 | 存中一贯

通过脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）将mRNA递送给抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APCs）依赖于对树突细胞（DCs）的定位以及之后的内吞和高效基因表达【1,2】。一般认为，LNP的设计需要考虑以下三个原则：1，颗粒表面携带中性或者阴性电荷，以保证生理pH状态下颗粒的惰性；2，使用胆固醇或者聚乙二醇以防止颗粒聚集，维持LNP的大小（小于200nm），以便于细胞内吞；3，阻止mRNA通过内体-溶酶体途径进行降解【3,4】。这种设计在SARS-CoV-2的mRNA疫苗设计中得到了很好的利用，但同样的策略被用于靶向黑色素瘤进行肿瘤mRNA疫苗设计时遇到了问题。与COVID-19中强免疫原刺突蛋白不同，肿瘤的免疫原已经和机体的免疫系统交织在一起【5,6】。之前类似的研究设计虽然具有一定的效果，但由于受到免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的限制，以及颗粒mRNA载量限制，以前的mRNA疫苗很难有效抑制肿瘤进展。

近日，来自美国佛罗里达大学的Elias J. Sayour带领团队在Cell杂志发表了文章RNA aggregates harness the danger response for potent cancer immunotherapy，他们构建了一种新的mRNA疫苗递送体系，扩大了脂质纳米颗粒的粒径的载量，并成功用于肿瘤mRNA疫苗的设计和试验。

研究人员利用mRNA作为分子桥，并使用脂质、胆固醇以及PEG等作为辅助最终构建了新的递送系统RNA LPAs。新的阳离子颗粒能够形成200-500 nm的聚合体，其zeta电位约为50 mV。通过聚集，颗粒的粒径在不断增大，包括Cas9-sgRNA和质粒DNA在内的所有核酸分子都能成功包装进入脂质体内。体外实验显示，这些RNA-LPAs能够稳定的表达抗原表位的mRNA并用于MHC呈递。研究人员还发现，RNA脂质颗粒聚合体的功能与聚合体中RNA和LPA的比例有关，经过实验，研究人员最终确定了RNA:LPA为1:15的比例进行后续实验。

根据上述发现，研究人员在B16F0肿瘤模型中检测了RNA-LPAs的效果，结果显示，RNA-LPAs的抗肿瘤功能主要来自大的聚合体（200-500 nm），另外，肿瘤特异的mRNA比非特异mRNA对照的效果好，免疫过的动物能够抵抗肿瘤细胞二次接种引起的肿瘤复发，而在重度免疫缺陷SCID小鼠中，来自肿瘤组织的mRNA-LPAs的优异效果消失，说明了机体抗原特异以及适应性免疫系统在RNA-LPAs中发挥的重要作用。

研究人员发现，RNA-LPAs能够递送多种不同的负载，比如同时递送GFP mRNA和靶向PD-L1的siRNA，在目标细胞中实现GFP表达和PD-L1敲低的联合效果。RNA-LPAs还能与免疫检查点协同发挥作用，在B16F0黑色素瘤小鼠模型中，这种联合策略能够增加针对肿瘤mRNA源的gp-100特异性肿瘤浸润性淋巴细胞的数量。

研究人员接下来探究了RNA-LPAs的作用机制，通过在tdTomato小鼠中注射编码Cre的RNA-LPAs，研究人员发现其定位在脾脏白髓的交界处，并在周围血管基质细胞中诱导tdTomato的表达。共定位分析显示，表达tdTomato的细胞是层粘连蛋白阳性的，这表明它们是脾脏和淋巴结中的成纤维细胞网状细胞（fibroblastic reticular cells, FRCs）。这些发现表明了RNA-LPAs在脾脏和淋巴结中的定位模式，并暗示了它们可能在全身的网状内皮（reticuloendothelial, RE）器官中有类似的分布。

体内实验中，RNA-LPA注射在血液中诱发了细胞因子的快速上调，包括CCL2，CCL4，CXCL9-10等，细胞因子反应在注射后6小时达到顶峰，24小时后逐渐消退。同时，RNA-LPA诱发了外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的招募，其表现为短暂性单核细胞减少症（monocytopenia）和淋巴细胞减少症（lymphopenia），以及淋巴网站器官中活化的DC细胞和T细胞数量的增加。有趣的是，这些免疫学现象不止在外周循环系统中出现，还在肿瘤微环境（TME）中也有类似的现象。TME中的炎症变化发生在RNA-LPA注射的48小时之内，主要表现为抗原呈递、IFN信号通路以及细胞毒性相关基因表达增强，同时免疫细胞向TME的浸润也获得增强。

接下来，研究人员在犬类胶质瘤模型中检测了RNA-LPA的作用。结果显示，RNA-LPA在犬类外周血中引起了细胞因子的快速释放以及单核细胞的短暂减少，单核细胞的短暂减少发生在2小时，而淋巴细胞的短暂减少则发生在6小时，这些现象同时伴随着实验犬的体温上升。另外，RNA-LPA引起了TME的快速重塑，一些抗原呈递、IFN信号途径以及细胞毒性途径相关基因表达上调。RNA-LPA改善了实验犬的中位生存期。

最后，研究人员在FDA批准下进行了首次人体试验（NCT04573140），这项试验对RNA-LPA的可行性、安全性和活性进行了评估。研究人员发现RNA-LPA在病人体内诱发了快速的炎症反应和短暂的单核细胞减少（2小时）以及淋巴细胞减少（6小时），另外，外周血中APCs也快速减少，说明它们被招募到了淋巴器官中。外周血中循环DCs和CD8淋巴细胞数目快速增加。与传统数据相比，RNA-LPA病人的无进展生存期从6个月增加到8个月和9个月。说明了RNA-LPA确实能够促进肿瘤的治疗。

综上所述，本研究设计开发了一种新的RNA递送体系RNA-LPA，扩大了脂质颗粒的负载能力，通过细胞、动物以及临床试验，发现RNA-LPA能够引起动物或者病人外周血炎症反应，对TME进行重塑，大大提高了病人的生存能力，为多种肿瘤的治疗提供了新的方法。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.003

制版人：十一

参考文献

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